Dissertação de Mestrado #734 – Sabrina Ferreira dos Santos – 04/10/2024

A microscopia de reflexão interna total, do inglês, Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF), é uma poderosa técnica de microscopia de campo evanescente que se baseia na excitação de fluoróforos por meio de um campo evanescente gerado através do fenômeno de reflexão interna total de um feixe incidente na interface entre dois meios de diferentes índices de refração. Devido ao decaimento exponencial do campo evanescente com a distância, a principal aplicação do TIRF se dá no mageamento e estudo da dinâmica, de estruturas e fenômenos biológicos que ocorrem na região aderida da membrana plasmática celular em escala nanométrica por meio da análise da fluorescência excitada. Com o objetivo de se ter acesso à esta técnica e caracterizar os seus parâmetros físicos, no presente trabalho é apresentado um protocolo de montagem óptica para o acoplamento da funcionalidade da microscopia TIRF via objetiva em um microscópio invertido utilizando um laser diodo 488 nm. Este protocolo inclui um teste de qualidade que consiste em uma análise qualitativa de uma solução de microesferas fluorescentes que atesta a efetividade da montagem apresentada. A caracterização do sistema é feita seguindo um segundo protocolo experimental baseado no fenômeno de reflexão interna total frustrada que determinou e quantificou o comportamento exponencial do campo evanescente em função da distância. Esta caracterização permitiu, portanto, identificar os fatores capazes de reduzir o fenômeno de espalhamento intrínseco a esses sistemas e analisar a precisão das medidas dos ângulos de incidência do feixe de excitação.

Palavras-chave: TIRF, Campo Evanescente, Reflexão Interna Total.