Tese de Doutorado #113: Ubirajara Batista

Objetos de fase podem se tornar visíveis por uma pequena desfocalização em um microscópio óptico, uma técnica pouco usada como ferramenta útil. Neste trabalho, revisitamos a teoria de desfocalização e a aplicamos ao estudo de nosso microscópio com óptica corrigida no infinito. Na nossa aproximação, encontramos que o contraste na imagem é proporcional ao Laplaciano em duas dimensões da diferença de fase introduzida pelo objeto de fase. Se o índice de refração do objeto de fase é uniforme, a imagem obtida da desfocalização do microscópio é a imagem da curvatura (Laplaciano da espessura local) do objeto de fase, enquanto a microscopia padrão de contraste de fase, fornece informação sobre a espessura do objeto. Construímos objetos de fase artificiais e medimos o contraste com a microscopia de desfocalização. Os resultados obtidos para o contraste estão de acordo com os resultados de nosso modelo teórico. Utilizamos a microscopia de desfocalização para estudar as flutuações de curvatura (ruffles) na superfície de macrófagos (célula do sistema imune inato), e tentamos correlacionar as propriedades mecânicas da superfície dos macrófagos com a fagocitose. Observamos grandes estruturas propagantes e coerentes: medimos sua forma, velocidade, densidade e estimamos sua energia de curvatura. Inomogeneidades do índice de refração, flutuações de curvatura e/ou mudanças periódicas nas interações membrana-citoesqueleto causam flutuações aleatórias no contraste da imagem. Pelas funções de correlação espacial e temporal do contraste obtemos o tempo de decaimento e o comprimento de correlação dessas flutuações que, estão relacionados com o seu tamanho e com as propriedades viscoelásticas do citoesqueleto. Para associar a dinâmica do citoesqueleto com o processo de fagocitose, usamos uma pinça óptica para segurar uma partícula de zymosan e colocá-la em contato com o macrófago. Então, medimos o tempo para um único processo de fagocitose. Adicionamos a droga cytochalasin D, que despolimeriza a rede de filamentos de actina do citoesqueleto: ela inibe as grandes flutuações coerentes e propagantes na superfície da célula, aumenta o tempo de relaxação das flutuações do citoesqueleto e aumenta o tempo de fagocitose. Nossos resultados sugerem que os métodos desenvolvidos neste trabalho podem ser úteis para mostrar a importância da motilidade do citoesqueleto na dinâmica dos processos celulares, como a fagocitose de macrófagos.